Construcción de un Vector de Virus de Planta Portando una Secuencia Mutagenizada del GEN NEF Del HIV-1

Abstract

Los vectores de virus de plantas representan una alternativa excelente como sistema de expresión de proteínas heterólogas, especialmente de biofármacos y vacunas multicomponentes. Diferentes antígenos del HIV-1 han sido expresados exitosamente en plantas a través de sistemas de transformación estable o expresión transitoria. Dentro del grupo de proteínas que componen el virión del HIV, Nef es considerada un blanco promisorio para la formulación de vacunas debido al papel que desempeña durante los primeros pasos de la infección viral. En el presente trabajo se reportan los resultados de la construcción de una quimera viral portando una secuencia modificada del gen nef del HIV-1. Se introdujeron dos sustituciones puntuales en los sitios reconocidos por las enzimas de restricción XhoI y KpnI utilizando la técnica de amplificación por PCR. Con este propósito se emplearon dos cebadores mutagénicos y dos silvestres en tres rondas de amplificación por PCR para cada sustitución. Los amplicones portadores de la doble mutación fueron ligados al vector de expresión viral pTMV30B-GFPC3, y se multiplicaron por transformación en células de E. coli XL1-blue; los cuales fueron posteriormente purificados y analizados por digestión y secuenciación. Los productos de la transcripción in vitro de esta quimera se inocularon en plantas de Nicotiana benthamiana, y la infectividad de los transcriptos se validó por sintomatología y RT-PCR. Los resultados demostraron que la quimera viral construida produjo transcriptos infectivos capaces de inducir síntomas característicos en las plantas inoculadas; lo cual abre la posibilidad para desarrollar una vacuna anti-HIV producida en plantas.